Zusammengenommen zeigen puma basket beige diese Ergebnisse, dass EGFR und EGFRvIII beide paradoxerweise mit proapoptotischen Proteinen koexprimieren und spezifisch mit PUMA in menschlichem GBM interagieren. Unter Verwendung einer Kohorte von 101 Gliomen und 12 normalen Hirngeweben untersuchten wir die Spiegel von EGFR / EGFRvIII und PUMA über IHC . Die Ergebnisse zeigen eine signifikante positive Korrelation zwischen den Expressionsniveaus von EGFR / EGFRvIII und PUMA (p = 0,039). Wie in 2a gezeigt, ist das Ausmaß der EGFR / EGFRvIII-PUMA-Coexpression bei hochgradigen / malignen Gliomen (20% bei AAs und 34,1% bei GBMs) signifikant höher als bei niedriggradigen Gliomen (6,3-7,7%). ) und normales Hirngewebe (0%).

Um zu untersuchen, ob PUMA für die Induktion von Apoptose in GBM essentiell ist, wurde PUMA-spezifische siRNA verwendet, um die PUMA-Expression und die Reaktion von U87MG-GBM-Zellen, die sehr puma basket black niedrige EGFR-Spiegel exprimieren, auf Anisomycin, einen potenten Induktor von, herunter zu regulieren Apoptose [38] wurde untersucht. Wie in 3a gezeigt, zeigte der TUNEL-Assay, dass PUMA Knockdown U87MG-Zellen resistent gegen Apoptose (2,5%) macht, induziert durch 48-stündige Anisomycin-Behandlungen. Im Gegensatz dazu erfahren mit der puma basket bow Kontroll-siRNA transfizierte U87MG-Zellen eine signifikante Anisomycin-induzierte Apoptose (45,5%). In dem Assay repräsentieren die gelben fusionierten Signale nuklear fragmentierte DNA.

U87MG-Zellen wurden mit Kontroll-siRNA und PUMA-spezifischer siRNA 24 Stunden lang transfiziert und 48 Stunden lang 100 ng / ml Anisomycin, einem wirksamen Apoptose-Induktor, ausgesetzt. Die Zellen wurden dann dem TUNEL-Assay unterzogen, um das Ausmaß der Apoptose zu bestimmen. Rote Fluoreszenz: mit Propidiumiodid gefärbte Kerne. Grüne Fluoreszenz: fragmentierte DNA. Gelbe fusionierte Signale: Kernfragmentierte DNA. (B) Western Blot zeigt einen spezifischen und effizienten PUMA-Expressions-Knockdown nach der Transfektion von puma basket classic damen PUMA-spezifischer siRNA an, jedoch keine Kontrolle von nicht zielgerichteter siRNA. (C) Eine erhöhte EGFRvIII-Expression verleiht GBM-Zellen eine Resistenz gegen Apoptose.

U87MG-Vektor- und U87MG-EGFRvIII-stabile Transfektantenzellen wurden 48 Stunden lang 100 ng / ml Anisomycin ausgesetzt und dem TUNEL-Assay unterzogen, um das Ausmaß der Apoptose zu bestimmen. Die Erzeugung und Charakterisierung der isogenen Zelllinien wurde bereits beschrieben [9]. (D) Western Blot zeigt an, dass U87MG-Vektorzellen ein sehr geringes Maß an endogenem EGFR (höheres Molekulargewicht; 175 kD) exprimieren, während U87MG-EGFRvIII-Zellen eine signifikante EGFRvIII-Expression (140 kD) enthalten -Expression von EGFRvIII in U87MG-Zellen führte zu einer signifikanten Resistenz gegen Anisomycin-induzierte Apoptose (3c, d).

U87MG-EGFR- und U87MG-EGFRvIII-stabile Transfektanten und T98G-GBM-Zellen mit endogenem EGFR wurden mit 1% DMSO und 1 & mgr; M Apoptose-induzierendem Staurosporin (ST) behandelt, geerntet und einer Immunpräzipitation / Western Blot (linkes Feld) und Western Blot (rechts) unterzogen panel), wie bereits beschrieben. Es ist bekannt, dass sich PUMA auf den Mitochondrienmembranen befindet, um bei entsprechendem Stress eine Apoptose puma basket grau auszulösen [40; 41]. Begründet durch unsere Daten, die zeigen, dass EGFR und EGFRvIII PUMA gemeinsam exprimieren und interagieren und dass diese beiden Wege umgekehrt mit Apoptose verbunden sind, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII die subzelluläre PUMA-Lokalisierung regulieren könnte.

EGFR-spezifische siRNA reduzierte wirksam die EGFR-Expression, wie durch die Western-Blots gezeigt (5c-rechts). Zusätzlich zu GBM-Zellen fanden wir, dass PUMA im Zytoplasma von menschlichen MDA-MB-468-Brustkrebszellen lokalisiert ist (5d), von denen bekannt ist, dass sie signifikante Mengen von endogenem EGFR exprimieren [34]. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass PUMA im Zytoplasma von EGFR- und EGFRvIII-exprimierenden GBM- und Brustkrebszellen konstitutiv und unter apoptotischem Stress sequestriert wird.